ГОСТР 50474-93 (идентичен ГОСТу 30518-97) Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий);
ГОСТ 29184-91 Методы выявления и определения количества бактерий семейства ENTEROBACTERIACEAE;
ГОСТ 7702.2.2-93 Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты птичьи. Методы выявления и определения количества бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий родов Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Serratia);
ГОСТ 9958-81 Колбасные изделия и продукты из мяса. Методы бактериологического анализа;
ГОСТ 9225-84 Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа;
ГОСТ 30364.2-96 Продукты яичные. Методы микробиологического контроля.
ГОСТ 21237-75 Мясо. Методы бактериологического анализа. ГОСТ 20235.2-74 Мясо кроликов. Методы бактериологического анализа.
ГОСТ 30425-97 Консервы. Метод определения промышленной стерильности.
Методические указания МЗ СССР 4.2.012-82.
ГОСТ 30518-97/Р 50474-93 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий).
Читайте также:
ГОСТ 30726-2001 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli.
а) Выявление колиформных бактерий в определенной навеске продукта. Для посева используется то количество продукта, в котором, в соответствии с установленными нормами, предусматривается отсутствие бактерий группы кишечных палочек (БГКП). При определении присутствия (отсутствия) колиформных бактерий в определенной навеске продукта или его эквивалентном разведении эту навеску (или разведение) вносят в одну из следующих питательных сред (бульон лактозный с бриллиантовым зеленым и желчью, бульон Мак-Конки, среда Кесслера) в двух повторностях. В ряде случаев, помимо перечисленных сред, допускается использование сред Хейфеца (при исследовании яичных продуктов, колбасных изделий и изделий из мяса, мяса птицы, субпродуктов и полуфабрикатов птичьих). При посеве соотношение между количеством высеваемого продукта (или его разведением) и питательной средой должно составлять 1:9, а для сред двойной концентрации—1:1.
При анализе очень кислых продуктов возможно существенное снижение pH питательной среды (на 0,5 и более единиц), обусловленное внесением в нее такого продукта (или его разведения). Поэтому в подобных случаях pH среды обязательно доводят до допустимого значения при помощи стерильного раствора гидроокиси натрия (100 г/дм 3 ).
Посевы культивируют при 36(±1)°С в течение 24-48 ч. Через 24(±3) ч проводят предварительный учет и отмечают положительные посевы. Окончательный учет проводят через 48(±3) ч. Положительными считают посевы, в которых отмечены признаки интенсивного роста микроорганизмов — помутнение среды, образование газа, изменение цвета среды, свидетельствующее о ее подкислении. При отсутствии признаков роста (газообразования или изменения цвета среды) делают заключение о соответствии исследуемого продукта нормативу.
При необходимости для подтверждения принадлежности выделенных микроорганизмов к колиформным бактериям производят высев из жидких сред штрихами на поверхность агаризованных селективно-диагностических сред (агар лактозный с бриллиантовым зеленым и феноловым красным, среда Эндо). В ряде случаев помимо перечисленных сред допускается также использование сред Левина (при исследовании мяса, мяса кроликов, колбасных изделий и продуктов из мяса, мяса птицы, субпродуктов и полуфабрикатов птичьих) и Плоскирева (при исследовании мяса, мяса кроликов, колбасных изделий и продуктов из мяса). Описание колоний, характерных для колиформных бактерий, приведено в таблице ниже. Из посевов отбирают не менее чем по пять характерных колоний.
Из каждой выбранной колонии готовят мазки и окрашивают их по Граму. К колиформным бактериям относятся аэробные и факультативно-анаэробные, не образующие спор грамотрицательные палочки, сбраживающие лактозу с образованием кислоты и газа. Результат считают положительным при обнаружении хотя бы одной колонии колиформных бактерий.
б) Определение количества колиформных бактерий посевом на агаризованные селективно-диагностические среды. Метод используется для анализа пищевых продуктов, содержащих в 1 г твердого продукта более 1500 либо в 1 см 3 жидкого продукта (или смыва) более 150 КОЕ колиформных бактерий.
1. Первый способ. По 0,1 или 0,2 см 3 навески продукта или его разведения (либо смыва) наносят на поверхность подсушенной плотной селективно-диагностической среды (агар лактозный с бриллиантовым зеленым или среда Эндо), разлитой в две параллельные чашки Петри. Посевной материал немедленно равномерно растирают по поверхности среды стеклянным шпателем. Засеянную поверхность подсушивают, выдерживая чашки в горизонтальном положении в течение 15 мин.
Затем чашки переворачивают дном вверх и инкубируют при температуре 36(±1) °С в течение 24-48 ч. По окончании срока инкубации посевы просматривают и отмечают рост характерных колоний. Отбирают для дальнейшего анализа чашки, на которых выросло от 15 до 150 характерных колоний. Для подтверждения принадлежности выделенных микроорганизмов к колиформным бактериям отбирают не менее чем по пять подозрительных колоний. Из каждой отобранной колонии готовят мазки и окрашивают их по Граму. Колиформные бактерии являются грамотрицательными палочками. Если подтверждается, что из выбранных пяти колоний не менее четырех характерных колоний (т. е. не менее 80 %) можно отнести к колиформным бактериям, то считают, что все характерные колонии на чашке Петри принадлежат к этим бактериям. В остальных случаях количество колиформных бактерий определяют исходя из процентного отношения подтвержденных колоний к общему количеству характерных колоний, взятых для подтверждения.
- Читайте также:
Пересчет количества колиформных бактерий на 1 г (см 3 ) продукта осуществляют по формуле:
Конечный результат вычисления выражают числом от 1,0 до 9,9×10 n .
2. Второй способ. Используют метод мембранных фильтров. Подготовка указанных фильтров и аппарата для фильтрования, а также сама техника фильтрования описаны в разделе, посвященном определению ОКБ и ТКБ воды.методом мембранных фильтров. Если анализу подвергают растворы, содержащие антимикробные вещества, или растворы с высоким осмотическим давлением, то после осаждения микроорганизмов на фильтре его промывают стерильной дистиллированной водой (или пептонно-солевым раствором). Фильтры с осевшими на них бактериями, не переворачивая, переносят на поверхность лактозного агара с бриллиантовым зеленым или среды Эндо.
При этом важно, чтобы между средой и фильтром не было пузырьков воздуха. В дальнейшем ход анализа аналогичен описанному выше. Для пересчета количества колиформных бактерий на 1 г (или 1 см 3 ) продукта число колоний, выросших на фильтре (даже если их число меньше 15), умножают на степень разведения и делят на объем профильтрованной жидкости.
в) Определение количества колиформных бактерий посевом в агаризованные селективно-диагностические среды. Метод используется для исследования пищевых продуктов, содержащих в 1 г твердого продукта более 150 или в 1 см 3 жидкого продукта (смыва) более 15 КОЕ колиформных бактерий.
По 1 см 3 навески продукта или его разведения вносят в две параллельные стерильные чашки Петри. Не позднее, чем через 15 мин чашки заливают 15-20 мл расплавленной и охлажденной до 45(±1)°С селективно-диагностической среды (лактозный агар с бриллиантовым зеленым или среда Эндо). Содержимое чашек немедленно осторожно перемешивают круговыми движениями. После застывания среды чашки переворачивают вверх дном. В дальнейшем анализ проводят как описано в выше.
г) Определение количества колиформных бактерий методом наиболее вероятного числа. Метод предназначен для пищевых продуктов, содержащих в 1 г твердого продукта менее 150 или в 1 см 3 жидкого продукта (смыва) менее 15 клеток колиформных бактерий.
Высевают три последовательные навески продукта и (или) его разведения, отличающиеся по количеству продукта в них в 10 раз. Каждую навеску (разведение) в трехкратной повторности высевают в колбы или пробирки с селективной средой (бульон лактозный с бриллиантовым зеленым и желчью, или бульон Мак-Конки, или среда Кесслер). Соотношение между посевным материалом и питательной средой 1:9, а для сред двойной концентрации—1:1. Посевы культивируют при 36(±1 )°С в течение 24-48 ч.
-
Читайте также:
В дальнейшем ход анализа аналогичен описанному выше. НВЧ определяют по количеству колб (пробирок) с положительным результатом, используя при этом специальные таблицы. Положительными считают посевы, в которых отмечены признаки роста в жидкой среде, и при последующем пересеве которых на плотные среды и подтверждении характерных колоний хотя бы одна из них отнесена к колиформным бактериям.
д) Выявление колиформных бактерий при определении промышленной стерильности пастеризованных газированных фруктовых соков и напитков. Перед анализом необходимое количество сока или напитка отбирают в стерильную колбу с ватной пробкой. Затем колбу с продуктом помещают в водяную баню температурой 30-35 °С и, встряхивая колбу, освобождают продукт от углекислоты. Отсутствие выделения пузырьков газа свидетельствует о завершении процесса. После этого продукт нейтрализуют до pH 7,0(±0,3) стерильным раствором гидроокиси натрия массовой концентрацией 100 г/дм 3 . Значение pH контролируют по индикаторной бумаге или при помощи рН-метра.
Если продукта из одной упаковочной единицы недостаточно для определения, то объединяют две или более единицы в одну.
Подготовленный описанным выше образом продукт высевают в одну из селективных сред (бульон лактозный с бриллиантовым зеленым и желчью, бульон Мак-Конки, среда Кесслер). При этом высевают: три объема по 100 см 3 — во флаконы (колбы), содержащие по 100 см 3 среды двойной концентрации; три объема по 10 см 3 — в пробирки, содержащие по 10 см 3 среды двойной концентрации; три объема по 1 см 3 — в пробирки, содержащие по 10 см 3 среды нормальной концентрации. В дальнейшем анализ проводят как описано выше.
е) Выявление и определение количества Е. coli. При исследовании на наличие Е. coli в определенном продукте необходимую навеску последнего или его эквивалентное разведение высевают на среду Кесслер с лактозой. Посевы инкубируют при 44(±1) °С в течение 24-48 ч и затем регистрируют образование газа. Из положительных посевов производят посев штрихом на поверхность плотной селективно-диагностической среды (среда Эндо и др.) с таким расчетом, чтобы получить изолированные колонии. Посевы культивируют 18-24 ч при 36(±1) °С.
По три характерных колонии каждого типа пересевают в пробирки со скошенным МПА и инкубируют 18-24 ч при 36(±1)°С. Одновременно из каждой выбранной колонии готовят мазки и окрашивают их по Граму, определяют наличие оксидазы.
Дальнейшую дифференциацию выделенных культур (оксидазоотрицательных, грамотрицательных палочек) проводят по тестам ИМАЦ (реакции на индол, метил-рот, ацетилметилкарбинол и цитрат), утилизации глюкозы, сорбита, целлобиозы, способности к образованию сероводорода.
1. Тест на индол. Культуру со скошенного МПА петлей пересевают в пробирку с 5 см 3 мясопептонного бульона с триптофаном и инкубируют 24 ч при 36(±1)°С. Выявление индола проводят так же, как описано в разделе 5.2.8.4.
3. Тест с метил-рот проводят параллельно с постановкой теста Фогес-Проскауэра. В пробирку с культурой, выращенной на мясопептонном бульоне с глюкозой, после отбора культуральной жидкости для реакции на ацетилметилкарбинол, добавляют 4-5 капель индикатора метил-рот. Если реакция положительная (имеет место образование кислоты из углеводов), то появляется красное окрашивание.
-
Читайте также:
4. Тест на утилизацию цитрата. Культуру со скошенного МПА петлей пересевают на цитратную среду Козера или на среду Симмонса. Посевы инкубируют 96 ч при 36(±1) °С. Отсутствие роста и изменения цвета среды свидетельствуют об отрицательной реакции. При положительной реакции наблюдается наличие роста и изменение окраски среды с оливково-зеленого цвета на васильковый.
Для выявления способности к сбраживанию глюкозы, целлобиозы и сорбита используют соответствующие среды. Посевы инкубируют 24 ч при 36(±1)°С. Изменение цвета среды вследствие кислотообразования свидетельствует о том, что исследуемые микроорганизмы способны к ферментации субстрата, входящего в состав среды. Е. coli, сбраживают глюкозу и сорбит, но не ферментируют целлобиозу.
Для определения способности образовывать сероводород культуры с МПА высевают методом укола в столбик среды Кристенсена и инкубируют при 36(±1)°С в течение 24-48 ч. Микроорганизмы, образующие сероводород, окрашивают среду в черный цвет.
Обобщают все полученные результаты. К Е. coli относят аэробные и факультативно-анаэробные не образующие спор грамотрицательные палочки, оксидазоотрицагельные, образующие газ из лактозы при 44(±1)°С, дающие положительную (или отрицательную реакцию на индол), положительную реакцию с метил-рот, отрицательную реакцию на цитрат и отрицательную реакцию Фогес-Проскауэра, ферментирующие глюкозу и сорбит и не ферментирующие целлобиозу. Е. coli не образует сероводород. Бактерии, не сбраживающие сорбит и целлобиозу, но по другим биохимическим признакам показавшие типичные для Е. coli реакции, относят к сорбитотрицательным штаммам Е. coli.
Если при подтверждении характерных колоний не менее двух из выбранных трех колоний (т. е. не менее 66%) можно отнести к Е. coli, то считают, что все характерные колонии на чашке Петри принадлежат к Е. coli. В остальных случаях количество Е. coli определяют исходя из процентного отношения подтвержденных колоний к общему количеству характерных колоний, взятых для подтверждения. Количественный учет Е. coli в 1 г (или 1 см 3 ) продукта можно производить методом НВЧ по количеству положительных посевов в жидкую среду (принцип метода).
При необходимости выявляют также способность дезаминировать фенилаланин (Е. coli не дезаминирует фенилаланин) и способность расщеплять мочевину (Е. coli не расщепляет мочевину).
Для определения способности бактерий дезаминировать фенилаланин производят обильный посев суточной культуры, выращенной на МПА, в пробирки со скошенным фенилаланиновым агаром. Посевы культивируют в термостате при 36(±1)°С в течение 4-24 ч, после чего на поверхность скошенного агара с культурой вносят по 4-5 капель раствора хлорного железа (FeCl3*6H2O) массовой концентрацией 100 г/дм 3 . При дезаминировании фенилаланина среда окрашивается в зеленый цвет.
Для установления способности расщеплять мочевину культуру высевают на среду Кристенсена с мочевиной и инкубируют при 36(+1)°С в течение 24 ч. При наличии бактерий, расщепляющих мочевину, среда становится резко щелочной и приобретает малиновый цвет.
Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 10.10.2019
Дата введения 1995-01-01
1 Методы отбора проб и подготовка к исследованиям
1 Методы отбора проб и подготовка к исследованиям – по ГОСТ 7702.2.0/ГОСТ Р 50396.0
2 Проведение исследования
3 Обработка результатов
3.3.3 Результаты количественного определения бактерий группы кишечных палочек записывают, как указано в ГОСТ 7702.2.1/ГОСТ Р 50396.1, 3.3.
Средства для стирки. Общие технические условия
Товары бытовой химии в аэрозольной упаковке. Общие технические условия
Товары бытовой химии. Общие технические требования
Товары бытовой химии. Методы определения фосфорсодержащих соединений
Товары бытовой химии. Методы определения анионного поверхностно-активного вещества
Товары бытовой химии. Метод определения смываемости с посуды
Товары бытовой химии. Метод определения нерастворимого в воде остатка (абразива)
ГОСТ 30518-97/ГОСТ Р 50474-93
Food products. Methods for detection and quantity determination of coliformes
Дата введения 1994-01-01
4 Постановлением Госстандарта России от 16 апреля 1998 г. N 122 ГОСТ 30518-97 введен в действие в качестве государственного стандарта Российской Федерации с момента принятия указанного постановления и признан имеющим одинаковую силу с ГОСТ Р 50474-93 на территории Российской Федерации в связи с полной аутентичностью их содержания
5.1.2, 5.5, 6.3, 6.4, 6.5
Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты и устанавливает метод выявления в определенной навеске пищевого продукта колиформных бактерий и три метода определения их количества: метод наиболее вероятного числа (НВЧ) и методы посева в или на агаризованные селективно-диагностические среды.
1 Сущность методов
1 Сущность методов
Методы выявления и определения наиболее вероятного числа колиформных бактерий основаны на высеве определенного количества продукта и (или) разведений навески продукта в жидкую селективную среду с лактозой, инкубировании посевов, учете положительных пробирок (колб), пересеве, при необходимости, культуральной жидкости на поверхность агаризованной селективно-диагностической среды для подтверждения по биохимическим и культуральным признакам роста принадлежности выделенных колоний к колиформным бактериям.
Методы определения количества колиформных бактерий посевом в (на) агаризованные селективно-диагностические среды основаны на высеве определенного количества продукта или его разведений в или на агаризованную селективно-диагностическую среду с лактозой, инкубировании посевов, подсчете типичных колоний, подтверждении, при необходимости, по биохимическим признакам принадлежности выделенных колоний к колиформным бактериям.
2 Отбор и подготовка проб
3 Аппаратура, материалы, реактивы и питательные среды
весы лабораторные общего назначения с метрологическими характеристиками по ГОСТ 24104* с наибольшим пределом взвешивания 200 г, 2-го класса точности (для взвешивания реактивов);
поплавки (трубки Дархема);
термостат с диапазоном рабочих температур 28-55 °С, позволяющий поддерживать заданную температуру с допустимой погрешностью ±1 °С.
желчь говяжья сухая или натуральная;
3.2 Для проведения испытания применяют питательные среды:
агар лактозный с бриллиантовым зеленым и феноловым красным;
бульон лактозный с бриллиантовым зеленым и желчью;
4 Подготовка к испытанию
4.2.6 Жидкие среды двойной концентрации готовят по 4.2.2-4.2.4, но при приготовлении берут удвоенную массу (объем) ингредиентов, кроме дистиллированной воды, и разливают в посуду с учетом последующего количества добавляемого жидкого продукта.
5 Проведение испытания
5.1.2 При определении количества колиформных бактерий посевом на агазированные селективно-диагностические среды по 0,1 или 0,2 см навески продукта или его разведения наносят на поверхность одной из сред, приготовленных по 4.2.1 или 4.2.5 и разлитых в две параллельные чашки Петри. Подготовку чашек Петри со средой к посеву и посев проводят по ГОСТ 26670.
При применении метода мембранных фильтров по ГОСТ 26670 фильтры переносят на поверхность агаризованной селективно-диагностической среды, избегая образования пузырьков воздуха между средой и фильтром. Поверхность фильтра с осевшими на ней бактериями должна быть обращена вверх.
5.1.3 При определении количества колиформных бактерий по методу НВЧ высевают три последовательные навески продукта и (или) его разведения, отличающиеся по количеству продукта в них в 10 раз.
Каждую навеску продукта и (или) его разведение в трехкратной повторности высевают в колбы или пробирки с одной из питательных сред, приготовленной по одному из следующих пунктов: 4.2.2, 4.2.3, 4.2.4.
5.2 Посев для выявления колиформных бактерий в определенной навеске продукта
5.4 Посевы на агаризованных и жидких средах инкубируют при температуре (36±1) °С в течение 24-48 ч. Чашки Петри с посевами инкубируют дном вверх. Посевы просматривают через (24±3) ч, отмечают положительные посевы в жидкие среды, а окончательный учет проводят через (48+3) ч.
5.6 Посевы на агаризованных средах по 5.1 и 5.5 после инкубирования просматривают и отмечают рост характерных колоний.
На агаре лактозном с бриллиантовым зеленым и феноловым красным колиформные бактерии образуют ярко-желтые колонии диаметром 2-4 мм с желтой прозрачной зоной диаметром 1-3 мм вокруг колонии.
На среде Эндо колиформные бактерии образуют колонии бледно-розового или красного цвета, часто с металлическим блеском.
Колиформные бактерии являются грамотрицательными палочками.
6 Обработка результатов
6.3 При определении НВЧ или при выявлении колиформных бактерий в определенной навеске продукта посевы в жидких средах считают положительными, если при последующем пересеве и подтверждении характерных колоний хотя бы в одной колонии будут обнаружены колиформные бактерии.
6.4 Если при подтверждении характерных колоний в 80% случаев, то есть не менее чем в 4 из 5 колоний, подтвержден рост колиформных бактерий, то считают, что все характерные колонии, выросшие на чашке Петри (см. п.5.6), принадлежат к колиформным бактериям. В остальных случаях количество колиформных бактерий определяют, исходя из процентного отношения подтвержденных колоний к общему количеству характерных колоний, взятых для подтверждения.
Читайте также:
