Кишечная палочка это продуцент

Кишечная палочка (Escherichia coli, E. coli) является палочковидной бактерией, принадлежащей к группе факультативных анаэробов (живет и размножается только в условиях отсутствия прямого кислорода).

Она имеет множество штаммов, большинство из которых принадлежит к естественной микрофлоре кишечника людей и помогает предотвращать развитие вредоносных микроорганизмов и синтезировать витамин К. Однако некоторые её разновидности (например, серотип О157:Н7) способны вызвать серьезные отравления, кишечный дисбактериоз и колибактериоз.

Нормальная микрофлора кишечника включает в себя множество микроорганизмов, среди которых – лактобактерии, энтерококки, стрептококки и проч. Штаммы этих бактерий находятся в равновесии, но если последнее каким-либо образом нарушится, патогенные микроорганизмы начнут усиленно размножаться. При этом активизируются процессы брожения и гниения, вызывая развитие серьезных заболеваний.

Некоторые штаммы кишечной палочки вызывают не только заболевания желудочно-кишечного тракта, но поражают также мочеполовую систему, провоцируют кольпит, цистит, простатит, менингит у младенцев, иногда становятся причиной развития гемолитически-уремического синдрома, перитонита, мастита, пневмонии и сепсиса.

Функции кишечной палочки в организме человека

Бактерии группы кишечной палочки необходимы для жизнедеятельности человека. В этой группе присутствуют различные микроорганизмы, которые называются колиформными бактериями.

Они составляют всего один процент от микрофлоры кишечника и решают ряд важных задач:

• выполняют защитную функцию, препятствуя развитию болезней;
• своим присутствием способствуют размножению бифидо- и лактобактерий;
• участвуют в обмене жиров и холестерина;
• участвуют в выработке витаминов В (всей группы) и K;
• улучшают всасывание соединений с железом и кальцием;
• укрепляют именную систему детей (до 7 лет).

Воздействие полезной кишечной палочки неоценимо в течение всей жизни, но патогенные штаммы этих бактерий провоцируют болезни, вызывают отравления, уничтожают полезную среду кишечника, деструктивно влияют на иммунитет взрослых и детей. В последнем случае это опасно вдвойне, поскольку неокрепший детский организм становится беззащитным к агрессивной внешней среде.

Кишечная палочка в норме

В нормальных условиях кишечная палочка заселяет кишечник человека (безопасные ее штаммы), среднее количество варьирует от 106 до 108 КОЕ/г содержимого дистального отдела кишечника (КОЕ – колониеобразующая единица). Содержание E.coli в составе другой микрофлоры кишечника не более 1%. В обычных условиях кишечная палочка принимают участие в нормальном функционировании кишечника, синтезирует витамины К, В1, В2, В3, В5, В6, В9, B12. Очень важная функция – конкурентное взаимодействие с условно-патогенной флорой кишечника (ограничение размножения условно-патогенных микроорганизмов).

Непатогенный штамм Nissle 1917 (Mutaflor) применяется с лечебной целью у детей в качестве пробиотика при дисбактериозе кишечника. В кишечнике более полезны так называемые лактозопозитивные кишечные палочки, содержание лактозонегативных не должно превышать 105 КОЕ/г, а гемолитические E. coli и вовсе должны отсутствовать.

Качественный и количественный состав E.coli толстого кишечника у здоровых людей разных возрастов, как у детей до года, так и старше 60 лет, не имеет различий. Для типичных E.coli это 107-108 КОЕ/г фекалий, E.coli лактозонегативные

Болею циститом 25 лет.В августе 2016 было резкое обострение с температурой 39 в течение 3 дней.Делали посев нашли кишеную палочку.Лечили гентамицином,нолицином,таваником,канефроном,фитолизином и закончила 2 месяца Уро=Ваксоном.Все это сопровождалось отваром урологический сбор.Сейчас сказали что вылечить невозможно.Неужели нет врачей и средств,которые могут вылечить?

ЗАКОН УТИЛИЗАЦИИ. ВСЁ ДОЛЖНО КУДА-ТО ДЕВАТЬСЯ.

Кишечная палочка считается одним из самых распространенных бактерий. Область ее обитания – кишечник человека и некоторых животных. Считается, что после попадания в окружающую среду (бактерия выводится из организма вместе с каловыми массами), она может в течение длительного периода сохранять свою жизнеспособность даже под воздействием внешних факторов.

Бактерии рода кишечной палочки могут быть как безопасными для организма человека, так и патогенными, способными привести к развитию многочисленных заболеваний. Для этих патологий характерны свои ярко выраженные симптомы. При их появлении человеку необходимо срочно обратиться в медицинское учреждение, иначе недуг, вызванный возбудителем, может привести к развитию серьезных осложнений, жизненно-опасных для человека.

Характеристика микроорганизма

Кишечная палочка представляет собой бактерию рода Escherichia из семейства Enterobacteriaceae. Данный микроорганизм активно размножается в человеческом организме, в частности, в различных отделах кишечника. Попадая вместе с каловыми массами в окружающую среду, бактерия может на протяжении нескольких месяцев сохранять свою жизнеспособность. Активная микрофлора содержится в воде, почве, кале, а также в некоторых продуктах питания (особенно, в молоке, мясе).

Кишечную палочку принято разделять на непатогенную и патогенную. Представители нормальном микрофлоры, обитающие в кишечнике, оказывают ряд полезных для организма действий. Прежде всего, данные микроорганизмы нормализуют кишечную микрофлору, подавляя рост вредных бактерий. Кроме того, они синтезируют витамин К, необходимый для поддержания нормального процесса свертываемости крови и выполнения других важных функций в организме.

Некоторые из представителей данного вида способны выделять ферменты, расщепляющие лактозу. Однако, безопасными данные бактерии остаются лишь тогда, когда они находятся в полости кишечника. При проникновении в другие органы, непатогенная микрофлора может спровоцировать развитие воспаления.

Классификация и виды бактерий

Бактерии группы кишечной палочки могут быть безопасными и патогенными. В свою очередь, непатогенная микрофлора может быть лактозопозитивными (в большинстве случаев), то есть способными расщеплять лактозу, либо лактозонегативными, не имеющими такой способности.

Патогенные микроорганизмы принято разделять на следующие виды:

1. Энтерогеморрагическая кишечная палочка – группа бактерий, приводящая к развитию диареи и кишечных кровотечений;
2. Энтеропатогенная – бактерии данного вида негативно воздействуют на эпителиальный слой кишечника, разрушая его ворсинки. Результатом такого воздействия становится продолжительное нарушение стула и метаболических процессов;
3. Энтероинвазивная – микроорганизмы внедряются в ткани кишечных стенок, что приводит к развитию выраженного очага воспаления.

Причины и пути передачи

Необходимо понимать, какие причины способствуют проникновению патогенной кишечной палочки в организм и ее активизации (размножению) в кишечнике. К числу таких причин относят:

1. Нарушение микрофлоры кишечника, в частности, массовая гибель полезных микроорганизмов в результате заболеваний ЖКТ;
2. Патологии поджелудочной железы;
3. Воспаления в кишечнике;
4. Длительное употребление антибактериальных препаратов (несмотря на то, что данная лекарственная группа предназначена именно для борьбы с патогенной микрофлорой, бесконтрольный прием антибиотиков может привести к обратной ситуации: бактерии приспосабливаются к действию лекарства и теряют чувствительность к его активным веществам. В результате этого происходит усиленный рост численности вредной микрофлоры);
5. Несоблюдение правил личной гигиены;
6. Употребление зараженных продуктов питания и воды.

Кишечная палочка, относящаяся к патогенному виду, попадает в организм человека различными способами:

1. Через продукты питания. Например, если человек употребляет сырое молоко, мясо, не прошедшее должную термическую обработку, сырое молоко;
2. Контактно – бытовой способ, например, при контакте с больным человеком (через немытые руки), при использовании зараженных вещей и предметов обихода;
3. Родовой способ, когда бактерия передается новорожденному от больной матери;
4. Половой. Во время полового акта кишечная палочка также может проникнуть в организм, хотя происходит это довольно редко.

Характерные симптомы

При активном развитии патогенной кишечной палочки в организме человека, появляются специфические симптомы, такие как потеря аппетита, диарея, тошнота и рвота, болезненные ощущения в различных отделах живота. При этом меняется структура, цвет и запах каловых масс. Кал становится более жидким, водянистым, может приобретать слизистую консистенцию. Цвет его становится более светлым, возможно появление в каловых массах кровянистых прожилок. Кал приобретает более резкий и неприятный запах.

У больного наблюдается обильное отхождение рвотных масс. При этом рвота приобретает специфический зеленый оттенок и резкий запах. У пациента отмечается выраженная слабость, отсутствие работоспособности, головокружения. В тяжелых случаях развивается нарушение жидкостного баланса организма со всеми характерными для данного состояния симптомами (бледность, сухость эпидермиса и наружных слизистых оболочек, слабость, постоянная жажда).

Стадии и проявления

Клинические признаки развития опасных заболеваний, возбудителем которых является кишечная палочка патогенного типа, зависят от давности проникновения болезнетворной микрофлоры в кишечник, а также от количества бактерий и продуктов жизнедеятельности, выделяемых ими. В соответствии с этими параметрами, выделяют 3 стадии развития патологического процесса. Для каждой из них характерен свой набор признаков.

При нормальном течении патологического процесса происходит постепенное самоочищение кишечника, после чего наступает улучшение.

Осложнения и заболевания

Патогенная форма кишечной палочки может приводить к развитию весьма неприятных последствий, заболеваний, значительно нарушающих самочувствие человека, несущих реальную угрозу для его здоровья. У женщин кишечная палочка, проникающая в область уретры или влагалища, может привести к таким патологиям как кольпит, уретрит. Частыми заболеваниями, возникающими у представительниц прекрасного пола, являются цистит, эндометрит, пиелонефрит, аднексит. Также возникают различные неприятные симптомы, такие как сильный и болезненный зуд во влагалище, творожистые, резко пахнущие выделения из половых органов.

У мужчин развиваются такие патологии как обильная диарея, токсическое поражение организма, сопровождающееся рвотой, ухудшением общего состояния. Возможно развитие следующих заболеваний: простатит, орхит, эпидидимит, пиелонефрит, воспаление тканей мочевого пузыря и нарушение его функциональности (анурия, энурез).

Особенно опасной патогенная кишечная палочка считается для детей. У зараженного ребенка наблюдается значительная гипертермия, сильный и зловонный понос, потеря аппетита и массы тела, признаки обезвоживания, истощения. Нарушается работа иммунной системы. Появляются области нагноения, которые могут привести к токсическому заражению крови и внутренних органов.

Методы диагностики

Для того, чтобы назначить подходящее лечение, необходимо поставить точный диагноз. Для этого используют различные диагностические мероприятия. Прежде всего, врач проводит беседу с пациентом, устанавливает совокупность симптомов и жалоб, беспокоящих больного, длительность и обстоятельства их появления. После этого больному назначают различные лабораторные и инструментальные обследования.

Инструментальные способы диагностики необходимы для того, чтобы выявить поражения кишечника и других органов (почки, желчный пузырь). Использование таких методов необходимо не всегда, а только в том случае, если имеются симптомы соответствующих заболеваний.

Для выявления патологического процесса большое значение имеют именно лабораторные методы исследования, позволяющие не только выявить нарушения микрофлоры, но и определить конкретного возбудителя инфекции, оценить степень его чувствительности к тем или иным антибактериальным веществам. Это необходимо для выбора подходящей схемы лечения.

1. Анализ крови на кишечную палочку. В норме данный микроорганизм в крови не содержится. Если же бактерию обнаруживают, это говорит о том, что здоровье и жизнь человека находятся в опасности, ведь проникновение возбудителя в кровоток может спровоцировать развитие сепсиса (заражения крови) – жизненно-опасного состояния, способного привести к летальному исходу.
2. Исследование мочи. Обнаружение возбудителя в моче говорит о заражении органов мочевыделительной системы и необходимости срочной антибактериальной терапии. О стадии развития заражения судят по количеству бактерий, имеющимся признакам;
3. Мазок из влагалища. В норме кишечная палочка в мазке отсутствует. Если же она обнаружена, это свидетельствует о заражении органов репродуктивной системы;
4. Исследование кала. При развитии кишечной палочки данные микроорганизмы в большом количестве присутствуют в каловых массах (в норме содержание этих микроорганизмов допускается, но в значительно меньшем количестве). После того, как возбудитель обнаружен, выполняется процедура бактериального посева. То есть бактерию помещают в особую среду, после чего оценивают дальнейшее ее развитие и размножение. Это позволяет определить тип микроорганизма, его чувствительность к различным видам антибиотиков.

Методы терапии

Лечение патологий, вызванных кишечной палочкой, включает в себя следующие моменты:

1. Медикаментозная терапия и прием витаминов для восстановления иммунитета;
2. Использование средств – пробиотиков для нормализации кишечной микрофлоры и устранения дисбактериоза;
3. Соблюдение особого режима питания.

Медикаментозное лечение предполагает использование лекарственных средств различных групп. Это, прежде всего антибиотики, препараты для устранения воспалений в мочевыводящих органах, органах половой системы, средства, предотвращающие развитие обезвоживания, препараты, восстанавливающие здоровую микрофлору в кишечнике, витаминные препараты для укрепления иммунной системы.

Диета предполагает употребление большого количества кисломолочных продуктов, обогащенных полезными бактериями, овощей и фруктов, нормализующих процесс пищеварения, травяных отваров, обладающих противовоспалительным действием. Запрещено употребление блюд, тяжелых для переваривания и продвижения по пищеварительному тракту. Это жирные и жареные блюда, острые, соленые, сладкие продукты, газированная вода, полуфабрикаты, консервы и колбасные изделия, а также же продукты, вызывающие чувство дискомфорта у конкретного человека.

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Писанов Р. В., Монахова Е. В., Алексеева Л. П., Маркина О. В., Гончарова Л. А.

Ген zonula occludens toxin (zot) Vibrio cholerae, амплифицированный с помощью ПЦР, клонирован в составе векторной плазмиды pQE30 по сайтам BamHI-HindIII. Экспрессия гена происходит под контролем Т5-промотора. Штамм Escherichia coli M15[pREP4]pZot69, содержащий рекомбинантную плазмиду , является активным продуцентом белка 6His-Zot, который обладает биологической активностью на модели культур клеток, вызывая разрушение межклеточных плотных контактов в монослое. Продукт присутствует в клетках кишечной палочки в виде телец включения. Штамм-продуцент может быть использован для получения препаратов Zot в целях изучения его значимости как фактора вирулентности холерных вибрионов , как агента, повышающего проницаемость кишечника для некоторых лекарственных препаратов, и как адъюванта при иммунизации.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Писанов Р. В., Монахова Е. В., Алексеева Л. П., Маркина О. В., Гончарова Л. А.

An Escherichia coli Strain – Producer of the Zot-toxin of Vibrio cholerae

Vibrio cholerae zonula occludens toxin (zot) amplified with the PCR procedure, was cloned as part of pQE30 vector plasmid at BamHI-HindIII sites. The expression of the gene was controlled by T5 promoter. Eschericia coli strain M15 [pREP4] pZct69 containing the recombinant plasmid , is an active producer of 6His-Zot protein which manifests a biologic activity on the model of cellular cultures causing destructive injuries in the inter-cellular tight junctions of the monolayers. The product is found within the colibacillus cells as inclusion corpuscles. The producer strain may be used to obtain Zot preparations in order to study its significance as one of the cholera vibrio virulence factors and as an agent facilitating intestinal penetrability for certain medical drugs, as well as an immunization adjuvant.

Р.В.Писанов, Е.В.Монахова, Л.П.Алексеева, О.В.Маркина, Л.А.Гончарова ШТАММ ESCHERICHIA COLI – ПРОДУЦЕНТ ZOT-ТОКСИНА VIBRIO CHOLERAE

Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт

Ген zonula occludens toxin (zot) Vibrio cholerae, амплифицированный с помощью ПЦР, клонирован в составе векторной плазмиды pQE30 по сайтам BamHI-HindIII. Экспрессия гена происходит под контролем Т5-промотора. Штамм Escherichia coli M15[pREP4]pZot69, содержащий рекомбинантную плазмиду, является активным продуцентом белка 6His-Zot, который обладает биологической активностью на модели культур клеток, вызывая разрушение межклеточных плотных контактов в монослое. Продукт присутствует в клетках кишечной палочки в виде телец включения. Штамм-продуцент может быть использован для получения препаратов Zot в целях изучения его значимости как фактора вирулентности холерных вибрионов, как агента, повышающего проницаемость кишечника для некоторых лекарственных препаратов, и как адъюванта при иммунизации.

Ключевые слова: zonula occludens toxin, холерный вибрион, клонирование генов, рекомбинантная плазмида

Zonula occludens toxin относят к числу дополнительных факторов вирулентности холерных вибрионов [7]. Кодирующий его ген zot вместе с генами cep, orfU, ace и ctxAB входит в состав коровой области генома умеренного филаментозного фага СТХф, интегрированного в хромосому Vibrio cholerae и способного к горизонтальной передаче перечисленных генов от штамма к штамму [13]. Zot представляет собой белок с двойной функцией, являясь одновременно необходимой составляющей фагового морфогенеза [6, 13] и аналогом эукариотического модулятора межклеточных плотных контактов (tight junctions, tj) зонулина [7]. Оба белка имеют общий рецептор и механизм действия, состоящий в разрушении tj за счет полимеризации клеточного актина, что приводит к усилению проницаемости тканей и может обеспечивать более свободный доступ других токсинов, в том числе холерогена, к клеточной мембране [8, 9].

Установлено, что первичный продукт гена zot представляет собой белок с молекулярной массой (ММ) 45 кДа, который подвергается процессингу предположительно за счет специфических протеаз, синтезируемых холерными вибрионами, в результате чего образуются две молекулы. Первая из них (N-терминальная часть исходной формы размером 33 кДа) остается связанной с клеточной поверхностью и, скорее всего, является одной из субъединиц капсида СТХф, тогда как вторая (С-терминальный фрагмент размером

12 кДа) секретируется в просвет кишечника и обусловливает биологическое действие токсина [7].

Вместе с тем роль Zot как в патогенезе типичной холеры, так и в качестве самостоятельного фактора вирулентности нехолерогенных штаммов холерных вибрионов, содержащих неполный (ActxAB) СТХ-элемент [4], в том числе выделяемых от больных острой диареей на территории России и пограничных государств [2], изучена далеко не достаточно.

В последнее десятилетие Zot также широко исследуется в качестве агента, повышающего проницаемость кишечника и других тканей для лекарственных препаратов, обычно оказывающих терапевтическое действие только при парентеральном вве-

дении. Например, у крыс с экспериментальным диабетом пероральное введение инсулина совместно с Zot приводило к снижению содержания глюкозы в сыворотке крови до такого уровня, который наблюдался после парентерального введения гормона [9]; аналогичные данные получены и на приматах [7, 14]. Результаты этих экспериментов обнадеживают в плане возможности замены в недалеком будущем парентерального использования целого ряда терапевтических средств на пероральное [7]. Интересны и экспериментальные данные о применении Zot в качестве адъюванта при интраназальной иммунизации мышей различными белками [10, 12]. В частности, иммунизация мышей столбнячным анатоксином с добавлением Zot обеспечивала полную защиту против столбнячного токсина [11].

Дальнейшие исследования в указанных направлениях требуют наличия очищенных препаратов Zot. Получение их из штаммов V. cholerae представляется малоэффективным и сопряжено с рядом трудностей. Поэтому одним из перспективных решений данной задачи является клонирование гена zot в составе плазмидных векторов и создание продуцентов на основе лабораторных штаммов E. coli.

Ранее мы сообщали [3] о конструировании штаммов E. coli, экспрессирующих клонированный в составе векторной плазмиды pUC19 ген zot под контролем собственного промотора и lacZ-промотора, но продукция Zot этими штаммами была недостаточно высокой. В литературе имеются сообщения о рекомбинантных штаммах E. coli BL21 (DE3), экспрессирующем клонированный в составе pET28(+) ген zot под контролем Т7-промотора [15], и E. coli M15[pREP4], содержащем zot в составе pQE30 [5]. Использование этих штаммов позволяет получать искомый белок в препаративных количествах, однако такой продуцент отсутствует в распоряжении отечественных исследователей. Поэтому целью настоящей работы явилось клонирование гена zot с использованием вектора pQE30, обеспечивающего экспрессию чужеродных генов под контролем мощного Т5-промотора, и создание штамма E. coli – продуцента функционально активного белка Zot V. cholerae.

Материалы и методы

Донором ДНК для амплификации гена zot служил штамм V. cholerae О1 569В классического биовара.

В качестве хозяина для трансформации рекомбинантных плазмид использовали штаммы E. coli Jm103 (thi, strA, endA, sbcB15, hsdR4, A(lac-proAB), [F’, traD36, proAB, lacIqZ AM15]) (Pharmacia) и M15[pREP4] (NaIS, StrS, RifS, Thi-, Lac-, Ara+, Gal+, Mtl-, F-, RecA+, Uvr+, Lon+) (QIAGEN). В качестве вектора для клонирования использовали плазмиду pQE30 (QiAGEN).

Для культивирования штамма E. coli Jm103 использовали жидкую и агаризованную среду LB, для M15[pREP4] к средам добавляли 25 мг/мл канами-цина, а для соответствующих рекомбинантов – дополнительно 50 мкг/мл ампициллина и 0,5 % глюкозы. В качестве индуктора использовали изопропил-ß-D-тиогалактозид (ИПТГ) в конечной концентрации 1 мМ.

Хромосомную и плазмидную ДНК выделяли из клеток холерных вибрионов и кишечной палочки в соответствии с общепринятыми методами [1].

ДНК плазмиды и амплификатов гена zot расщепляли эндонуклеазами рестрикции BamHI и HindIII (Fermentas UAB) в течение 3-4 ч в соответствующем каждому ферменту буфере. Линейную форму плазмиды и амплификаты после рестрикции очищали в 0,7 % агарозном геле и лигировали с использованием ДНК-лигазы Т4 (Fermentas UAB) согласно рекомендациям изготовителя. Лигазной смесью трансформировали компетентные клетки E. coli Jm103, приготовленные с помощью обработки хлористым кальцием [1]. Трансформанты высевали на агар LВ, содержащий 50 мкг/мл ампициллина и 0,5 % глюкозы. Посевы культивировали при 37 °С в течение ночи. Отбирали ампициллинрезистентные колонии и определяли присутствие zot с помощью праймеров для детекции гена. Из позитивных клонов выделяли плаз-мидную ДНК, подтверждали наличие в ней вставки гена zot рестрикцией BamHI и HindIII с последующим электрофорезом в агарозном геле.

Рекомбинантной плазмидой трансформировали компетентные клетки E. coli M15[pREP4]; полученные рекомбинантные клоны проверяли на присутствие гена zot и плазмиды, как описано выше.

Для определения способности рекомбинантов к

продукции Zot их выращивали в жидкой среде LB, содержащей 50 мкг/мл ампициллина (без глюкозы) в течение 3-4 ч и индуцировали 1 мМ ИПТГ в течение 1, 2, 3 и 4 ч при 37 °С с шуттелированием при 150 об/мин. Контролем служил штамм, содержащий векторную плазмиду pQE30 без вставки. Клетки осаждали центрифугированием, лизировали в буфере, содержащем 65 мМ трис-НС1 (pH 6,8), 1 % SDS и 10 мМ 2-меркаптоэтанола, при температуре 96 °С в течение 10 мин. Лизат подвергали электрофорезу в 10 % полиакриламидном геле (ПААГ) с SDS и окрашивали гель Coomassi Blue R250.

Для определения локализации искомого продукта осадки клеток ресуспендировали в 50 мМ Na-фосфатном буфере (pH 8,0), содержащем 1 мМ фе-нилметилсульфонилфторида (PMSF) и 2 мг/мл ли-зоцима, инкубировали на льду в течение 30 мин, добавляли тритон X-100 до 1 % и ДНКазу до 5 мкг/мл, продолжали инкубацию на льду в течение 10 мин, затем замораживали в жидком азоте. После размораживания разделяли растворимую и нерастворимую фракции центрифугированием, добавляли к обеим лизис-буфер, прогревали при 100 °С в течение 10 мин и исследовали в электрофорезе. Процентное содержание Zot по отношению к суммарным клеточным белкам определяли с помощью программы Quantity One.

Для получения препарата-сырца Zot нерастворимую фракцию клеток рекомбинантного штамма, выращенного с индукцией ИПТГ, растворяли в 8 М мочевине, разбавляли равным объемом 10 мМ трис-HCl (рН 8,0), осветляли центрифугированием и подвергали многоступенчатому диализу с постепенным снижением концентрации мочевины в диализном буфере. Содержание общего белка в полученном таким образом препарате определяли методом Лоури.

Для оценки биологической активности Zot использовали культуры клеток эпителия тонкого кишечника человека СаСо2 и фибробластов мышей L-929 из Российской коллекции клеточных культур (Санкт-Петербург). Клетки культивировали соответственно в среде DMEM (Sigma) с 10 % сыворотки плода коровы в течение 5-7 сут и RPMI-1640 (Sigma) с 1 % сыворотки плода коровы в течение 12 сут (до образования плотного монослоя). Испытуемый препарат в разведениях 1:10 – 1:1600 вносили в 96-луночные планшеты с плотным клеточным монослоем и инкубировали в ССЬ-инкубаторе (Sanjo) при 37 °С. Морфологическое изучение культуры проводили в течение 2 дней с помощью инвертированного микроскопа (Reichert). Для фотографирования клетки фиксировали формалином и окрашивали по Романовскому-Гимза.

Результаты и обсуждение

На основе анализа нуклеотидной последовательности гена VC1458 (AE0038852) нами были сконструированы праймеры для ПЦР -синтеза гена zot (AF220606, AF414369, AF542088, AF542089):

и обратный -5′-AAATAAGCTTTCAAAATATACTATTTAGTC-3′.

Поскольку амплификат необходимо было

встроить в плазмидный вектор pQE30 в ориентации, обеспечивающей направление транскрипции под контролем Т5-промотора, на 5′-конце каждого праймера внесен сайт рестрикции для эндонуклеазы, образующей липкие концы: BamHI для прямого праймера и HindIII – для обратного (в приведенных последовательностях выделены жирным шрифтом и подчеркнуты) в соответствии с порядком расположения сайтов рестрикции в полилинкере векторной плазмиды.

В результате трансформации компетентных клеток E. coli Jm103 лигазной смесью получены клоны, несущие рекомбинантную плазмиду, обозначенную pZot69 (рис. 1). Гидролиз этой плазмиды BamHI и HindIII с последующим электрофорезом в агарозном геле подтвердил наличие вставки размером 1,2 т.п.н. Рекомбинантные клоны штамма E. coli Jm103pZot69, однако, не выдерживали длительного хранения на питательных средах даже в присутствии глюкозы и требовали частых пересевов, вероятно, в связи с недостаточно эффективной репрессией Т5-промотора и токсичностью Zot для E. coli. С целью создания более жизнеспособного продуцента мы транформировали pZot69 в штамм M15[pREP4], содержащий низкокопийную плазмиду pREP4, обеспечивающую дополнительную ре-

Рис. 1. Схема плазмиды pZot69

прессию Т5-промотора за счет конститутивной экспрессии входящего в ее состав гена lacI. Действительно, трансформанты оказались более жизнеспособными по сравнению с таковыми Jm103pZot69.

После SDS-электрофореза лизатов клеток E. coli M15[pREP4]pZot69, выращенных с индукцией, в 10 % ПААГ выявлена белковая линия с ММ

46 кДа, которая отсутствовала как в лизате клеток, выращенных без индукции, так и у контрольного штамма, содержащего векторную плазмиду (рис. 2А). Увеличение времени индукции от 1 до 4 ч не привело к повышению/снижению количества продукта, которое составляло, по данным программы Quantity One, приблизительно 6-7 % суммарных клеточных белков. Эти данные свидетельствуют о способности рекомбинантного штамма к активной экспрессии клонированного гена в присутствии ИПТГ.

Для определения локализации рекомбинантного Zot электрофорезу были подвергнуты также растворимая и нерастворимая фракции клеток (рис. 2Б). Как видно из рисунка, белок с ММ

46 кДа был выявлен в нерастворимой фракции (тельцах включения), где его содержание составляло —18—21 % суммарных клеточных белков.

Как было показано выше, рекомбинантный белок Zot, продуцируемый штаммом кишечной палочки, имел ММ —46 кДа, соответствующую рассчитанному значению для 6His-Zot, т.е. он не подвергался протеолитическому процессингу. Тем не менее, из литературных данных известно, что гиб-

12 3 4 # I 2 3 4 кДа

Рис. 2. SDS-электрофорез в 10 % ПААГ:

А – лизатов клеток рекомбинантных штаммов E. coli M15[pREP4], содержащих плазмиды pZot69 (дорожки 1, 2) и pQE30 (3, 4), выращенных без индукции (1, 3) и с индукцией ИПТГ (2, 4);

Б – нерастворимой (1, 3) и растворимой (2, 4) фракций выращенных с индукцией ИПТГ клеток E. coli M15[pREP4], содержащих плазмиды pQE30 (1, 2) и pZot69 (3, 4).

Рекомбинантный белок 6His-Zot указан стрелкой

Рис. 3. Действие препарата-сырца 6His-Zot

на культуры клеток CaCo2 (слева) и L-929 (справа).

Верхний ряд – контроль, нижний – разрушение tj под действием Zot

Таким образом, гибридный рекомбинантный белок Zot несмотря на отсутствие процессинга и присутствие в его молекуле дополнительных аминокислотных остатков обладает описанной для него биологической активностью – способностью вызывать разрушение tj в культурах клеток.

Использование рекомбинантного штамма E. coli M15[pREP4]pZot69 (КМ 193) в качестве про-

дуцента Zot в перспективе позволит выделять очищенный препарат с использованием специфически связывающих 6№8-белки сорбентов в целях изучения его значимости как фактора вирулентности холерных вибрионов, как агента, повышающего проницаемость кишечника для некоторых лекарственных препаратов и как адъюванта при иммунизации.

Преимуществом предлагаемого продуцента по сравнению с холерными вибрионами является также то, что его культивирование не требует соблюдения режима работы с возбудителями особо опасных инфекций.

1. Манниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии: Молекулярное клонирование / Пер. с англ. – М.: Мир, 1984. – 2. Монахова Е.В., Писанов Р.В., Михась Н.К. и др. // Журн. микробиол. – 2004. – № 2. –

C. 23-29. – 3. Писанов Р.В., Гончаров Е.К., Монахова Е.В. и др. // Мол. генет. – 2005. – № 1. – С. 28-32. – 4. Boyd E.F., Heilpern A.J., Waldor M.K. // J. Bacteriol. – 2000. -Vol. 182, N 19. – P. 5530-5538. – 5. Di Pierro M.D., Lu R., Uzzau S. et al. // J. Biol. Chemistry. – 2001. – Vol. 276, N 22. -P. 19160-19165. – 6. Faruque S.M., Albert M.J., Mekala-nos J.J. // Microbiol. Mol. Biol. Rew. – 1998. – Vol. 62, N 4. -P. 1301-1314. – 7. Fasano A. // Ann. N.Y. Acad. Sci. – 2001. -N 915. – P. 214-222. – 8. Fasano A., Baudry B., Pumplin

D.W. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1991. – Vol. 88. -P. 5242-5246. – 9. Fasano A., Uzzau S. // J. Clin. Invest. -1997. – Vol. 99, N 6. – P. 1158-1164. – 10. Marinaro M., Di Tomasso A., Uzzau S. et al. // Infect. Immun. – 1999. – Vol. 6, N 3. – P. 1287-1291. – 11. Marinaro M., Fasano A., De Magistris M.T. // Infect. Immun. – 2003. – Vol. 71, N 4. -P. 1897-1902. – 12. Rossi M., Maurano F., Luongo D. // Immunol. Lett. – 2002. – Vol. 81, N 3. – P. 217-221. – 13. Waldor M.K., Mekalanos J.J. // Science. – 1996. – Vol. 272, N 5269. -P. 1910-1914. – 14. Watts T.L., Alexander T., Hansen B. et al. // J. Invest. Med. – 2000. – Vol. 48. – P. 185. – 15. Zy H., Zy C., Wang D.N. et al. // Sheng Wu Gong Chen Xue Bao. -2000. – Vol. 16, N 5. – P. 570-573.

R.V.Pisanov, E.V.Monakhova, L.P.Alekseyeva, O.V.Markina, L.A.Goncharova

An Escherichia coli Strain – Producer of the Zot-toxin of Vibrio cholerae

Rostov-on-Don Anti-Plague Research Institute

Vibrio cholerae zonula occludens toxin (zot) amplified with the PCR procedure, was cloned as part of pQE30 vector plasmid at BamHI-Hindlll sites. The expression of the gene was controlled by T5 promoter. Eschericia coli strain M15 [pREP4] pZct69 containing the recombinant plasmid, is an active producer of 6His-Zot protein which manifests a biologic activity on the model of cellular cultures causing destructive injuries in the inter-cellular tight junctions of the monolayers. The product is found within the colibacillus cells as inclusion corpuscles. The producer strain may be used to obtain Zot preparations in order to study its significance as one of the cholera vibrio virulence factors and as an agent facilitating intestinal penetrability for certain medical drugs, as well as an immunization adjuvant.

Key words: zonula occludens toxin, cholera vibrio, genetic cloning, recombinant plasmid.

Читайте также: